Mata Kuliah : Kimia Bahan Alam
Kredit : 2 SKS
Dosen : Dr. Syamsurizal, M.Si
Hari/Tanggal : Sabtu, 24 november 2012
Waktu : 22-29 Desember 2012
PETUNJUK : Ujian ini open book. Tapi tidak diizinkan mencontek, bilamana ditemukan, maka anda dinyatakan GAGAL. Jawaban anda diposting di blog masing-masing.
Kredit : 2 SKS
Dosen : Dr. Syamsurizal, M.Si
Hari/Tanggal : Sabtu, 24 november 2012
Waktu : 22-29 Desember 2012
PETUNJUK : Ujian ini open book. Tapi tidak diizinkan mencontek, bilamana ditemukan, maka anda dinyatakan GAGAL. Jawaban anda diposting di blog masing-masing.
1. Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah
faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid
dalam kuantitas yang banyak.
2. Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda.
3. Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid.
4. Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contohnya.
2. Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda.
3. Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid.
4. Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contohnya.
Jawaban
1. Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan (unit) isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualena. Lebih dari 4000 jenis triterpenoid telah diisolasi dengan lebih dari 40 jenis kerangka dasar yang sudah dikenal dan pada prinsipnya merupakan proses siklisasi dari skualen. Senyawa ini berupa senyawa tak berwarna, berbentuk kristal, sering kali bertitik leleh tinggi dan aktif optik.
Mekanisme dari tahap-tahap reaksi biosintesis terpenoid adalah asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan asam aseto asetat.
Senyawa yang dihasilkan ini dengan asetil koenzim A melakukan kondensasi jenis aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalinat, reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforialsi, eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan isopentenil (IPP) yang selanjutnya berisomerisasi menjadi dimetil alil piropospat (DMAPP) oleh enzim isomeriasi. IPP sebagai unit isoprene aktif bergabung secara kepala ke ekor dengan DMAPP dan penggabungan ini merupakan langkah pertama dari polimerisasi isoprene untuk menghasilkan terpenoid.
Penggabungan ini terjadi karena serangan electron dari ikatan rangkap IPP terhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan electron diikuti oleh penyingkiran ion pirofosfat yang menghasilkan geranil. Pirofosfat (GPP) yaitu senyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoid.
Penggabungan selanjutnya antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama menghasilkan Farnesil pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawa antara bagi semua senyawa seskuiterpenoid. Senyawa diterpenoid diturunkan dari Geranil-Geranil Pirofosfat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu unti IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.
Senyawa yang dihasilkan ini dengan asetil koenzim A melakukan kondensasi jenis aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalinat, reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforialsi, eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan isopentenil (IPP) yang selanjutnya berisomerisasi menjadi dimetil alil piropospat (DMAPP) oleh enzim isomeriasi. IPP sebagai unit isoprene aktif bergabung secara kepala ke ekor dengan DMAPP dan penggabungan ini merupakan langkah pertama dari polimerisasi isoprene untuk menghasilkan terpenoid.
Penggabungan ini terjadi karena serangan electron dari ikatan rangkap IPP terhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan electron diikuti oleh penyingkiran ion pirofosfat yang menghasilkan geranil. Pirofosfat (GPP) yaitu senyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoid.
Penggabungan selanjutnya antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama menghasilkan Farnesil pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawa antara bagi semua senyawa seskuiterpenoid. Senyawa diterpenoid diturunkan dari Geranil-Geranil Pirofosfat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu unti IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.
Faktor - faktor yang mempengaruhi banyak sedikitnya hasil dari triterpenoid dalam jalur biosintasis triterpenoid adalah:
1. Pada saat penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprene, penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid, pembentukan senyawa-senyawa monoterpen dan senyawa terpenoida yang berasal dari penggabungan 3,3 dimetil allil pirofosfat dengan isopentenil pirofosfat.
2. Enzim yang bekerja, pH dan temperatur menjadi faktor penting keberhasilan terbentuknya senyawa hasil proses biosintesis seperti, senyawa triterpenoid.
1. Pada saat penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprene, penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid, pembentukan senyawa-senyawa monoterpen dan senyawa terpenoida yang berasal dari penggabungan 3,3 dimetil allil pirofosfat dengan isopentenil pirofosfat.
2. Enzim yang bekerja, pH dan temperatur menjadi faktor penting keberhasilan terbentuknya senyawa hasil proses biosintesis seperti, senyawa triterpenoid.
2. Kekhasan signal dan intensitas serapan struktur Flavonoid dengan menggunakan spektrum IR dan NMR adalah berdasarkan spectrumnya yang terdiri atas 2 maksimal pada rentang 240 - 280 nm (pita II) dan 300 - 550 nm (pita I) kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoid dan pola oksigenasi. Ciri khas dalam spektrum tersebut adalah memberikan puncak relatif rendah pada pita I untuk flavonoid golongan hidroflavon dan isoflavon dan untuk antosianin dan khalkon memberikan puncak yang relatif tinggi.
Spektrum RMI – 1H terlihat terutama di daerah 0 – 10 ppm medan bawah dari sinyal acuan tetrametilsilan (yang berdasarkan perjanjian ditetapkan pada 0 ppm). Hanya proton yang menghasilkan sinyal (beresonansi) di daerah ini dan proton yang secara kimia sama memberikan sinyal yang sama. Ukuran sinyal (integrasi) berbanding lurus dengan jumlah proton yang menghasilkan sinyal. Pada identifikasi flavanoid Spektroskopi Resonansi Magnet Inti (RMI – 1H ) digunakan khas untuk :
a. Penentuan pola oksigenasi (pada ketiga lingkar)
b. Penentuan jumlah gugus metoksi (dan kedudukannya)
c. Pembedaan isoflavon, flavonon, dan dihidroflavonol
d. Penentuan jumlah gula yang ada (dan penentuan apakah ikatannya α – atau β )
e. Pendeteksian rantai samping hidrokarbon seperti –CH3 yang terikat pada C dan prenil yang terikat pada C (atau O).
seperti gambar struktur di bawah ini:
Isoflavon
Spektrum RMI – 1H terlihat terutama di daerah 0 – 10 ppm medan bawah dari sinyal acuan tetrametilsilan (yang berdasarkan perjanjian ditetapkan pada 0 ppm). Hanya proton yang menghasilkan sinyal (beresonansi) di daerah ini dan proton yang secara kimia sama memberikan sinyal yang sama. Ukuran sinyal (integrasi) berbanding lurus dengan jumlah proton yang menghasilkan sinyal. Pada identifikasi flavanoid Spektroskopi Resonansi Magnet Inti (RMI – 1H ) digunakan khas untuk :
a. Penentuan pola oksigenasi (pada ketiga lingkar)
b. Penentuan jumlah gugus metoksi (dan kedudukannya)
c. Pembedaan isoflavon, flavonon, dan dihidroflavonol
d. Penentuan jumlah gula yang ada (dan penentuan apakah ikatannya α – atau β )
e. Pendeteksian rantai samping hidrokarbon seperti –CH3 yang terikat pada C dan prenil yang terikat pada C (atau O).
seperti gambar struktur di bawah ini:
Isoflavon
Flavon
3. Alkaloid
Sifat Alkaloid
Pada umumnya, basa bebas alkaloid hanya larut dalam pelarut organik, meskipun beberapa pseudoalkalod dan protoalkaloid larut dalam air. Garam alkaloid dan alkaloid quartener sangat larut dalam air.
Kebanyakan alkaloid bersifat basa. Sifat tersebut tergantung pada adanya pasangan elektron pada nitrogen. Jika gugus fungsional yang berdekatan dengan nitrogen bersifat melepaskan elektron, (contoh; gugus alkil). Sebaliknya, bila gugus fungsional yang berdekatan bersifat menarik elektron (contoh; gugus karbonil).
Kebasaan alkaloid menyebabkan senyawa tersebut sangat mudah mengalami dekomposisi, terutama oleh panas dan sinar dengan adanya oksigen. Hasil dari reaksi ini sering berupa N-oksida. Dekomposisi alkaloid selama atau setelah isolasi dapat menimbulkan berbagai persoalan jika penyimpanan berlangsung dalam waktu yang lama. Pembentukan garam dengan senyawa organik (tartarat, sitrat) atau anorganik (asam hidroklorida atau sulfat) sering mencegah dekomposisi.
Isolasi Alkaloid
Dua metode yang paling banyak digunakan untuk menyeleksi tanaman yang mengandung alkaloid. Prosedur Wall, meliputi ekstraksi sekitar 20 gram bahan tanaman kering yang direfluks dengan 80% etanol. Setelah dingin dan disaring, residu dicuci dengan 80% etanol dan kumpulan filtrat diuapkan. Residu yang tertinggal dilarutkan dalam air, disaring, diasamkan dengan asam klorida 1% dan alkaloid diendapkan baik dengan pereaksi Mayer atau dengan Siklotungstat. Bila hasil tes positif, maka konfirmasi tes dilakukan dengan cara larutan yang bersifat asam dibasakan, alkaloid diekstrak kembali ke dalam larutan asam. Jika larutan asam ini menghasilkan endapan dengan pereaksi tersebut di atas, ini berarti tanaman mengandung alkaloid. Fasa basa berair juga harus diteliti untuk menentukan adanya alkaloid quartener.
Prosedur Kiang-Douglas agak berbeda terhadap garam alkaloid yang terdapat dalam tanaman (lazimnya sitrat, tartrat atau laktat). Bahan tanaman kering pertama-tama diubah menjadi basa bebas dengan larutan encer amonia. Hasil yang diperoleh kemudian diekstrak dengan kloroform, ekstrak dipekatkan dan alkaloid diubah menjadi hidrokloridanya dengan cara menambahkan asam klorida 2 N. Filtrat larutan berair kemudian diuji terhadap alkaloidnya dengan menambah pereaksi mayer, Dragendorff atau Bauchardat. Perkiraan kandungan alkaloid yang potensial dapat diperoleh dengan menggunakan larutan encer standar alkaloid khusus seperti brusin.
Pada umumnya, basa bebas alkaloid hanya larut dalam pelarut organik, meskipun beberapa pseudoalkalod dan protoalkaloid larut dalam air. Garam alkaloid dan alkaloid quartener sangat larut dalam air.
Kebanyakan alkaloid bersifat basa. Sifat tersebut tergantung pada adanya pasangan elektron pada nitrogen. Jika gugus fungsional yang berdekatan dengan nitrogen bersifat melepaskan elektron, (contoh; gugus alkil). Sebaliknya, bila gugus fungsional yang berdekatan bersifat menarik elektron (contoh; gugus karbonil).
Kebasaan alkaloid menyebabkan senyawa tersebut sangat mudah mengalami dekomposisi, terutama oleh panas dan sinar dengan adanya oksigen. Hasil dari reaksi ini sering berupa N-oksida. Dekomposisi alkaloid selama atau setelah isolasi dapat menimbulkan berbagai persoalan jika penyimpanan berlangsung dalam waktu yang lama. Pembentukan garam dengan senyawa organik (tartarat, sitrat) atau anorganik (asam hidroklorida atau sulfat) sering mencegah dekomposisi.
Isolasi Alkaloid
Dua metode yang paling banyak digunakan untuk menyeleksi tanaman yang mengandung alkaloid. Prosedur Wall, meliputi ekstraksi sekitar 20 gram bahan tanaman kering yang direfluks dengan 80% etanol. Setelah dingin dan disaring, residu dicuci dengan 80% etanol dan kumpulan filtrat diuapkan. Residu yang tertinggal dilarutkan dalam air, disaring, diasamkan dengan asam klorida 1% dan alkaloid diendapkan baik dengan pereaksi Mayer atau dengan Siklotungstat. Bila hasil tes positif, maka konfirmasi tes dilakukan dengan cara larutan yang bersifat asam dibasakan, alkaloid diekstrak kembali ke dalam larutan asam. Jika larutan asam ini menghasilkan endapan dengan pereaksi tersebut di atas, ini berarti tanaman mengandung alkaloid. Fasa basa berair juga harus diteliti untuk menentukan adanya alkaloid quartener.
Prosedur Kiang-Douglas agak berbeda terhadap garam alkaloid yang terdapat dalam tanaman (lazimnya sitrat, tartrat atau laktat). Bahan tanaman kering pertama-tama diubah menjadi basa bebas dengan larutan encer amonia. Hasil yang diperoleh kemudian diekstrak dengan kloroform, ekstrak dipekatkan dan alkaloid diubah menjadi hidrokloridanya dengan cara menambahkan asam klorida 2 N. Filtrat larutan berair kemudian diuji terhadap alkaloidnya dengan menambah pereaksi mayer, Dragendorff atau Bauchardat. Perkiraan kandungan alkaloid yang potensial dapat diperoleh dengan menggunakan larutan encer standar alkaloid khusus seperti brusin.
Dasar-dasar Penggunaan Reagent
Beberapa pereaksi pengendapan digunakan untuk memisahlkan jenis alkaloid. Untuk mendeteksi alkaloid secara kromatografi digunakan sejumlah pereaksi. Pereaksi yang sangat umum adalah pereaksi Dragendorff, yang akan memberikan noda berwarna jingga untuk senyawa alkaloid. Namun demikian perlu diperhatikan bahwa beberapa sistem tak jenuh, terutama koumarin dan α-piron, dapat juga memberikan noda yang berwarna jingga dengan pereaksi tersebut. Pereaksi umum lain tetapi kurang digunakan adalah asam fosfomolibdat, jodoplatinat, uap jood, dan antimon (III) klorida.
Kebanyakan alkaloid bereaksi dengan pereaksi-pereaksi tersebut tanpa membedakan kelompok alkaloid. Sejumlah pereaksi khusus tersedia untuk menentukan atau mendeteksi jenis alkaloid khusus. Pereaksi Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehide yang diasamkan) memberikan warna yang sangat karakteristik biru atau abu-abu hijau dengan alkaloid ergot. Pereaksi serium amonium sulfat (CAS) berasam (asam sulfat atau fosfat) memberikan warna yang berbeda dengan berbagai alkaloid indol. Warna tergantung pada kromofor ultra ungu alkaloid.
Beberapa pereaksi pengendapan digunakan untuk memisahlkan jenis alkaloid. Untuk mendeteksi alkaloid secara kromatografi digunakan sejumlah pereaksi. Pereaksi yang sangat umum adalah pereaksi Dragendorff, yang akan memberikan noda berwarna jingga untuk senyawa alkaloid. Namun demikian perlu diperhatikan bahwa beberapa sistem tak jenuh, terutama koumarin dan α-piron, dapat juga memberikan noda yang berwarna jingga dengan pereaksi tersebut. Pereaksi umum lain tetapi kurang digunakan adalah asam fosfomolibdat, jodoplatinat, uap jood, dan antimon (III) klorida.
Kebanyakan alkaloid bereaksi dengan pereaksi-pereaksi tersebut tanpa membedakan kelompok alkaloid. Sejumlah pereaksi khusus tersedia untuk menentukan atau mendeteksi jenis alkaloid khusus. Pereaksi Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehide yang diasamkan) memberikan warna yang sangat karakteristik biru atau abu-abu hijau dengan alkaloid ergot. Pereaksi serium amonium sulfat (CAS) berasam (asam sulfat atau fosfat) memberikan warna yang berbeda dengan berbagai alkaloid indol. Warna tergantung pada kromofor ultra ungu alkaloid.
Contohnya :
1. Isolasi nikotin dari daun tembakau
Dengan dipotong-potong 10 gram daun tembakau kering atau tembakau dari cerutu. Ditambahkan 100 ml larutan NaOH 5% dan 30 ml air, diaduk. Disaring menggunakan corong Buchner. Untuk menghilangkan partikel (daun tembakau) dalam hasil saringan(filtrate), filtrate disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberi glasswool. Filtrat ditambahkan 30 ml diklorometan, dikocok. Dipisahkan lapisan diklorometan ke dalam labu Erlenmeyer. Langkah ekstraksi ini dilakukan sampai semua nikotin terekstrak ke dalam diklorometan. Dikumpulkan semua lapisan diklorometan. Diuapkan diklorometan menggunakan rotary vacuum evaporator. Penguapan diklorometan atau eter dilakukan menggunakan teknik penguapan dengan pengurangan tekanan dan jangan menggunakan api. Ditambahkan 1ml air suling ke dalam sisa penguapan, aduk perlahan-lahan, ditambahkan 4ml methanol, disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberi glass wool. Ditambahkan 10 ml larutan jenuh asam pikrat dalam methanol. Disaring nikotin dipikrat padat menggunakan corong Buchner (digunakan kertas saring). Dimurnikan nikotin, dengan rekristalisasi dan diperolh kristal murni.
2. Isolasi pada jambu keling
Endapan dikeringkan dan diektraksi dan direndam dalam khloroform dan dipekatkan dengan alat rotary evaporator.
Ekstrak pekat khloroform (2 g) dikhromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 sebanyak 60 gram dengan fasa gerak khloroform: metanol dengan menaikkan kepolaran bertingkat. Fraksi yang keluar kolom khromatografi ditampung menggunakan vial serta dimonitor dengan khromatografi lapis tipis. Fraksi dengan Rf yang sama dan positip dengan pereaksi Maeyer yang ditandai dengan munculnya warna putih, digabung selanjutnya, diuapkan pelarutnya kemudian fraksi ini direkristalisasi untuk memperoleh kristal murni.
3. Isolasi senyawa alkaloida yang terdapat pada biji tumbuhan mahoni
Dilakukan dengan teknik maserasi dengan pelarut methanol. Ekstrak metanol yang dihasilkan dipekatkan kemudian di ekstraksi partisi dengan n-heksana, kemudian diasamkan dengan HCl 2M sampai pH=2. dibasakan dengan Na2CO3 5% sampai pH = 8-9 kemudian diekstraksi partisi dengan dietil eter,lalu dipekatkan. Ekstrak pekat dietil yang merupakan alkaloida total dianalisis KLT lalu dipisahkan dengan kolom kromatografi dengan eluen kloroform : metanol ( 70:30 ) v/v yang menghasilkan kristal berwarna kuning pucat pada fraksi 10-15 dengan Rf=0,74 sebanyak 2,008 g dengan titik lebur 92-94 oC dan pada fraksi 18-20 dengan Rf=0,70 sebanyak 0,731 g dengan titik lebur 83-85 oC. Kristal tersebut dianalisis dengan menggunakan spektroskopi Infra Merah dan Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton.
4. Biosintesis, metode Isolasi dan penetuan struktur sangatlah berkaitan. Biosintesis merupakan proses dimana suatu senyawa itu mengalami pembentukan senyawa-senyawa baru dengan bantuan enzim, zat pereaksinya dan jalur yang terlibat dalam proses tersebut. Metode isolasi merupakan cara pemisahan suatu senyawa dari sampel yang akan diisolasi, pada isolasi kita harus memperhatikan pelarut yang akan digunakan dan sifat sampel yang akan diisolasi. Penentuan struktur senyawa bahan alam merupakan cara untuk mengidentifikasi suatu struktur dalam senyawa, dapat dilakukan dengan menggunakan hasil isolasi / isolate dari pemisahan yang sudah dilakukan, yaitu dengan penentuan spektroskopi (IR, NMR, UV ) dan kromatografi.
1. Isolasi nikotin dari daun tembakau
Dengan dipotong-potong 10 gram daun tembakau kering atau tembakau dari cerutu. Ditambahkan 100 ml larutan NaOH 5% dan 30 ml air, diaduk. Disaring menggunakan corong Buchner. Untuk menghilangkan partikel (daun tembakau) dalam hasil saringan(filtrate), filtrate disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberi glasswool. Filtrat ditambahkan 30 ml diklorometan, dikocok. Dipisahkan lapisan diklorometan ke dalam labu Erlenmeyer. Langkah ekstraksi ini dilakukan sampai semua nikotin terekstrak ke dalam diklorometan. Dikumpulkan semua lapisan diklorometan. Diuapkan diklorometan menggunakan rotary vacuum evaporator. Penguapan diklorometan atau eter dilakukan menggunakan teknik penguapan dengan pengurangan tekanan dan jangan menggunakan api. Ditambahkan 1ml air suling ke dalam sisa penguapan, aduk perlahan-lahan, ditambahkan 4ml methanol, disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberi glass wool. Ditambahkan 10 ml larutan jenuh asam pikrat dalam methanol. Disaring nikotin dipikrat padat menggunakan corong Buchner (digunakan kertas saring). Dimurnikan nikotin, dengan rekristalisasi dan diperolh kristal murni.
2. Isolasi pada jambu keling
Endapan dikeringkan dan diektraksi dan direndam dalam khloroform dan dipekatkan dengan alat rotary evaporator.
Ekstrak pekat khloroform (2 g) dikhromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 sebanyak 60 gram dengan fasa gerak khloroform: metanol dengan menaikkan kepolaran bertingkat. Fraksi yang keluar kolom khromatografi ditampung menggunakan vial serta dimonitor dengan khromatografi lapis tipis. Fraksi dengan Rf yang sama dan positip dengan pereaksi Maeyer yang ditandai dengan munculnya warna putih, digabung selanjutnya, diuapkan pelarutnya kemudian fraksi ini direkristalisasi untuk memperoleh kristal murni.
3. Isolasi senyawa alkaloida yang terdapat pada biji tumbuhan mahoni
Dilakukan dengan teknik maserasi dengan pelarut methanol. Ekstrak metanol yang dihasilkan dipekatkan kemudian di ekstraksi partisi dengan n-heksana, kemudian diasamkan dengan HCl 2M sampai pH=2. dibasakan dengan Na2CO3 5% sampai pH = 8-9 kemudian diekstraksi partisi dengan dietil eter,lalu dipekatkan. Ekstrak pekat dietil yang merupakan alkaloida total dianalisis KLT lalu dipisahkan dengan kolom kromatografi dengan eluen kloroform : metanol ( 70:30 ) v/v yang menghasilkan kristal berwarna kuning pucat pada fraksi 10-15 dengan Rf=0,74 sebanyak 2,008 g dengan titik lebur 92-94 oC dan pada fraksi 18-20 dengan Rf=0,70 sebanyak 0,731 g dengan titik lebur 83-85 oC. Kristal tersebut dianalisis dengan menggunakan spektroskopi Infra Merah dan Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton.
4. Biosintesis, metode Isolasi dan penetuan struktur sangatlah berkaitan. Biosintesis merupakan proses dimana suatu senyawa itu mengalami pembentukan senyawa-senyawa baru dengan bantuan enzim, zat pereaksinya dan jalur yang terlibat dalam proses tersebut. Metode isolasi merupakan cara pemisahan suatu senyawa dari sampel yang akan diisolasi, pada isolasi kita harus memperhatikan pelarut yang akan digunakan dan sifat sampel yang akan diisolasi. Penentuan struktur senyawa bahan alam merupakan cara untuk mengidentifikasi suatu struktur dalam senyawa, dapat dilakukan dengan menggunakan hasil isolasi / isolate dari pemisahan yang sudah dilakukan, yaitu dengan penentuan spektroskopi (IR, NMR, UV ) dan kromatografi.
Contohnya :
Isolasi Nikotin dari daun tembakau
25 gram daun tembakau kering rajangan yang telah dibungkus kertas saring dimasukkan ke dalam alat soxhlet, dilakukan ekstraksi dengan menggunakan 300 mL metanol selama 7 jam. Sampel yang digunakan adalah 100 gram sehingga ekstraksi dilakukan 4 kali. Ekstrak / filtrat yang dihasilkan dievaporasi sampai dihasilkan larutan yang pekat atau filtrat tinggal 10 % dari volume semula. Larutan pekat dituangkan ke dalam labu erlenmeyer dan diasamkan dengan H2SO4 2 M sebanyak 25 ml. Larutan diaduk dengan magnetik stirer agar homogen. Larutan diuji dengan kertas lakmus sampai berwarna merah. Kemudian larutan diekstrak dengan kloroform 25 ml sebanyak 3 kali dengan corong pisah. Ekstrak yang dihasilkan berada di lapisan bawah diuji dengan reagen Dragendorf, positip alkaloid jika timbul endapan orange. Ekstrak dinetralkan lagi dengan menambahkan NH4OH, kemudian diekstraksi lagi dengan kloroform 25 ml sebanyak 3 kali. Ekstrak yang diperoleh diuapkan dengan dianginkan, kemudian dimurnikan dengan kromatografi kolom dengan silika gel 11,5 gram sebagai fase diam, panjang kolom 10 cm, diameter kolom 3 cm dan dengan eluen n heksana dan kloroform, metanol dengan perbandingan 1:0, 7:3, 5:5, 3:7 dan 0:1 masing – masing sebanyak 10 ml. Hasil kromatografi kolom dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis dengan larutan pengembang metanol. Hasil ekstrak kemudian diuji dengan menggunakan GC–MS, spektrofotometer UV-Vis dan Spektrofotometer IR.
25 gram daun tembakau kering rajangan yang telah dibungkus kertas saring dimasukkan ke dalam alat soxhlet, dilakukan ekstraksi dengan menggunakan 300 mL metanol selama 7 jam. Sampel yang digunakan adalah 100 gram sehingga ekstraksi dilakukan 4 kali. Ekstrak / filtrat yang dihasilkan dievaporasi sampai dihasilkan larutan yang pekat atau filtrat tinggal 10 % dari volume semula. Larutan pekat dituangkan ke dalam labu erlenmeyer dan diasamkan dengan H2SO4 2 M sebanyak 25 ml. Larutan diaduk dengan magnetik stirer agar homogen. Larutan diuji dengan kertas lakmus sampai berwarna merah. Kemudian larutan diekstrak dengan kloroform 25 ml sebanyak 3 kali dengan corong pisah. Ekstrak yang dihasilkan berada di lapisan bawah diuji dengan reagen Dragendorf, positip alkaloid jika timbul endapan orange. Ekstrak dinetralkan lagi dengan menambahkan NH4OH, kemudian diekstraksi lagi dengan kloroform 25 ml sebanyak 3 kali. Ekstrak yang diperoleh diuapkan dengan dianginkan, kemudian dimurnikan dengan kromatografi kolom dengan silika gel 11,5 gram sebagai fase diam, panjang kolom 10 cm, diameter kolom 3 cm dan dengan eluen n heksana dan kloroform, metanol dengan perbandingan 1:0, 7:3, 5:5, 3:7 dan 0:1 masing – masing sebanyak 10 ml. Hasil kromatografi kolom dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis dengan larutan pengembang metanol. Hasil ekstrak kemudian diuji dengan menggunakan GC–MS, spektrofotometer UV-Vis dan Spektrofotometer IR.
1. Hasil Spektrofotometer Inframerah (IR) dalam Ekstrak Daun Tembakau Fraksi Metanol
Hasil identifikasi ekstrak tembakau fraksi metanol dengan menggunakan spektrofotometer IR menunjukkan adanya serapan yang khas di daerah bilangan gelombang 2950,9 cm-1 dan 2838,0 cm-1 menunjukkan adanya ikatan C – H , pada bilangan gelombang 1651,0 cm-1 menunjukkan adanya gugus aromatis, pada bilangan gelombang 1458,1 cm-1 menunjukkan adanya gugus –CH3 , pada bilangan gelombang 1396,4 cm-1 menunjukkan adanya gugus amina tersier aromatis, dan pada bilangan gelombang 1018,3 cm-1 menunjukkan adanya amina tersier alifatis. Adanya serapan pada bilangan gelombang 3398,3 menunjukkan adanya gugus –OH. Hal ini dikarenakan penggunaan pelarut metanol pada saat kromatografi kolom.
2. Hasil Uji dengan Spektrofotometer UV Ekstrak Daun Tembakau Fraksi Metanol
2. Hasil Uji dengan Spektrofotometer UV Ekstrak Daun Tembakau Fraksi Metanol
ekstrak daun tembakau mempunyai panjang gelombang 206 nm dan 262 nm. Dari literatur diperoleh panjang gelombang maksimum cincin piridin adalah 251 nm (π→π*) dan 270 nm (n→π*) dalam etanol. Perbedaan serapan maksimum mungkin disebabkan oleh perbedaan pelarut yang digunakan.
